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文库知几多——NGS文库浓度测定方法解析“亚博游戏娱乐平台”

发布时间:2021-12-31 15:40 点击数:
本文摘要:文库知几多——NGS文库浓度测定方法解析 关于NGS文库质检的事,上次我们聊了文库片段方面 文库知几多——NGS文库质检解析(点击检察),今天我们来聊聊文库浓度方面。对于illumina 测序平台,精确的文库浓度是得到高质量测序数据的前提,因为: 1、假如上机lane的浓渡过低,则导致数据产出少,将不能得到足够的测序数据,需要补测以到达需要的数据量,增加了测序用度和测序周期。2、假如上机lane的浓渡过高,将发生低质量的测序数据,甚至会导致测序失败。

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文库知几多——NGS文库浓度测定方法解析 关于NGS文库质检的事,上次我们聊了文库片段方面 文库知几多——NGS文库质检解析(点击检察),今天我们来聊聊文库浓度方面。对于illumina 测序平台,精确的文库浓度是得到高质量测序数据的前提,因为: 1、假如上机lane的浓渡过低,则导致数据产出少,将不能得到足够的测序数据,需要补测以到达需要的数据量,增加了测序用度和测序周期。2、假如上机lane的浓渡过高,将发生低质量的测序数据,甚至会导致测序失败。

别的,今朝主流的illumina测序仪Novaseq 6000每张S4测序芯片可以产出至少3.2T的数据,而单个样品需要的数据量远远小于一张芯片的产出,因此,凡是将多个样品混淆到一起举行测序,后续再按照每个样品建库时用的index标签来区分;混淆到一起的各个样品的产出,理论上与其物质的量占比成正比,举个例子:假设只有A和B两个样品,物质的量各占50%,则产出100G数据时,理论上A有50G,B有50G;当A占90%,B占10%,产出100G数据时,理论上A为90G,B为10G。由此可看出,精确靠得住的文库浓度一方面决定了一张测序芯片的产出,另一方面决定了混淆文库中各个子文库的产出。大白了文库浓度检测的重要性,下面我们来聊聊几种常见的文库浓度检测方法。一、 紫外接收法 紫外接收法的道理是:核苷、核苷酸、核酸的构成身分中都有嘌呤、嘧啶碱基,这些碱基都具有共轭双键,在紫外光区的250-280nm处有强烈的光接收感化,最大接收值在260nm阁下,因此可以操纵核酸的紫外接收性举行浓度定量。

接纳紫外接收法举行浓度定量的常见仪器有NanoDrop分光光度计(如图1),NanoDrop分光光度计操作轻便,迅速,但缺点是无法区分DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质,别的,待测样品的浓度小于100ng/ul时,检测成果的变异度增大,可信度不高,因此,该仪器更推荐用于检测提取后的DNA或者RNA的质量,通过比力A260/A280和A260/A230的比值判断提取后核酸的纯度。纯RNA的A260/A280 ≥2.0,DNA的A260/A280 ≥1.8,当样品中杂质含量较高时,比值下降,RNA和DNA的比值别离低于2.0和1.8时,发起纯化除去杂质。展开全文 图1 二、 荧光染料法 荧光染料法的道理是:荧光染料与特异性的靶分子(DNA、RNA或者卵白质)联合后发出的荧光强度比未联合前的荧光强度高很多,可以减少游离荧光对配景信号的滋扰,且所发生的荧光强度与特异性靶分子的浓度成正比,这样纵然在杂质污染条件下,也不会受到滋扰,从而获得靠得住的浓度。

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荧光染料法常用的仪器有Qubit(如图2),通过使用差别的荧光染料,可以特异性地检测双链DNA、RNA或卵白质,检测灵敏度高且反复性好,双链DNA浓度低至0.5ng/ul也只需1ul即可完成检测。图2 三、 及时荧光定量PCR法(qPCR法) 及时荧光定量PCR技能(qPCR法)是荧光检测技能和PCR技能的联合,在PCR反映体系中插手荧光基团,通过及时监测整个PCR历程中荧光信号的变化环境,反应浓度的变化环境,最后通过已知浓度的尺度曲线计较未知样品的浓度。qPCR仪器主流的品牌有Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。

qPCR法涉及到PCR扩增历程,在PCR扩增时特异性的引物仅会定量两头讨论毗连完整的文库(即可测序的文库),可解除单端或双端都不毗连讨论的不行测序文库的滋扰,是今朝业内举行文库定量最推荐的方法。最后,小编再分享一些小我私家的经验,由于荧光染料法无法区分单端或双端都不毗连讨论的不行测序文库,获得的浓度可能偏高,因此qPCR法成为了文库浓度定量最推荐的方法,因为该方法只会检测两头讨论毗连完整的文库,可是qPCR法也有其局限性,假如文库中有抑制PCR扩增的杂质存在,qPCR法定量获得的浓度会偏低。因此,发起联合两种方法的成果举行判断,选择最精确的文库浓度。

相信不少老师对于浓度检测也存在一些迷惑:为什么各家公司检测的成果差异如此巨大?下面就这个环境小编来分享一些小我私家的想法。浓度检测的成果受仪器状态、人员操作、试剂耗材等因素影响,个中仪器状态因素不需过多思量,重点思量的因素是人员操作和试剂耗材。检测浓度的移液体积都很是少,约1-5ul,因此很是磨练操作人员使用移液器的程度,成果偏离预期较大时,首先应摆设从头检测;试剂耗材也是一个重要的影响因素,下面我们以qPCR尝试的简化模型作为例子说明,qPCR尝试未知样品的浓度是通过已知浓度的尺度品计较得出,差别厂商尺度品的实际浓度与宣称的有差异,以图3作个简朴的说明,假设B厂商尺度品B的浓度是真实的10nM,此时待测样品浓度与尺度品B对比,可得出待测样品浓度为5nM;但假如我们将待测样品与同样宣称浓度是10nM但实际浓度是5nM的尺度品A对比,我们就会得出待测样品浓度为10nM,这样一看,只是尺度品差别,成果却相差了2倍。

图3 最后,我们用一个表格来总结3种浓度检测方式吧。返回,检察更多。


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